Qual é a diferença entre Sequenciamento 16S e Sequenciamento Shotgun?

Qual escolher para estudos de microbioma?

Ao planejar um novo estudo, muitos pesquisadores de microbioma têm essa mesma dúvida. Isso acontece porque é possível encontrar publicações sobre microbioma que abrangem estudos tanto com Sequenciamento do Gene 16S rRNA quanto com Sequenciamento Metagenômico Shotgun.

Ambos os métodos são utilizados para gerar dados que servirão de base para análises de perfis microbianos ou metagenômicos. Cada método tem os seus prós e contras, por isso no blog de hoje, abordaremos a comparação Sequenciamento 16S vs Sequenciamento Shotgun:

O que é o Sequenciamento do gene 16S rRNA?

O Sequenciamento 16S, emprega a técnica de PCR para selecionar e amplificar segmentos das regiões hipervariáveis (V1-V9) do gene bacteriano 16S rRNA¹. Os amplicons de amostras separados recebem códigos de barras moleculares, e são agrupados e sequenciados. Após o sequenciamento, os dados brutos são analisados através de um pipeline bioinformático.

Esse pipeline inclui: corte, correção de erros e comparação com uma base de dados consolidada de referência 16S. Depois que as leituras são atribuídas a uma classificação filogenética, poderá ser gerado um perfil taxonômico. Do mesmo modo, o sequenciamento ITS segue o mesmo procedimento, mas visa a região ITS (Internal Transcribed Spacer) presente nos genomas dos fungos.

O que é o Sequenciamento Metagenômico Shotgun?

Em comparação ao Sequenciamento 16S, que se concentra apenas nos genes do rRNA 16S, o Sequenciamento Metagenômico Shotgun abrange todo o DNA genômico de uma amostra. Lembrando que o processo de preparação da biblioteca é semelhante ao de sequenciamento regular de genomas completos, incluindo etapas como fragmentação aleatória e ligação de adaptadores.

Para criar um perfil taxonômico é realizada a análise dos dados metagenômicos obtidos por Sequenciamento Shotgun, geralmente seguindo os seguintes passos:

1. Recorte de qualidade dos dados
2. Comparação com um banco de dados de referência. Podendo ser com dados de genomas completos (como o Kraken² e o Centrifuge³) ou de genes marcadores selecionados (como MetaPhlAn⁴ e mOTU⁵).

Uma vez que o Sequenciamento Metagenômico Shotgun abrange todas as informações genéticas de uma amostra, os dados podem ser usados para análises adicionais. Por exemplo:

• A montagem e separação de informações metagenômicas
• A avaliação das funções metabólicas
• A identificação de genes relacionados à resistência a antibióticos.

SEQUENCIAMENTO 16S/ITS VS SEQUENCIAMENTO METAGENÔMICO SHOTGUN

Se o seu estudo necessitar de análises além da caracterização taxonômica, como a investigação de vias metabólicas, o Sequenciamento Metagenômico Shotgun é a escolha mais adequada devido à sua ampla cobertura genômica e produção de dados. Se o foco do estudo estiver no perfil da composição, ambas as técnicas têm vantagens e desvantagens a serem avaliadas. Para mais informações, consulte a Tabela 1 abaixo:

Qual a diferença da Resolução Taxonômica dos Sequenciamentos?

A resolução taxonômica no Sequenciamento 16S/ITS depende das regiões variáveis selecionadas, do organismo em questão e do algoritmo utilizado para analisar as sequências. Nos últimos anos, certos métodos de correção de erros, como o DADA2⁶, aprimoraram significativamente a precisão e a resolução taxonômica dessa técnica. Com o DADA2, a resolução ao nível da espécie é agora alcançada para muitos organismos com o sequenciamento 16S padrão.

Embora em teoria, o Sequenciamento Metagenômico Shotgun obtém resolução completa ao nível de espécie, abrangendo todas as variações genéticas, na prática, ainda existem alguns desafios técnicos para alcançar essa precisão. Mesmo assim, o Sequenciamento Metagenômico Shotgun oferece uma resolução mais alta em comparação com o Sequenciamento 16S/ITS.

E se meu estudo tiver como objetivo determinar o Perfil Funcional?

Se o objetivo for a análise da função metabólica, a maior parte dos pesquisadores rapidamente ignorará a o Sequenciamento 16S e ITS. No entanto, existem algumas ferramentas que permitem inferir a função metabólica a partir de dados taxonômicos, por exemplo, PICRUSt⁷. Porém, o Sequenciamento Metagenômico Shotgun é mais utilizado quando seu objetivo for necessário para determinar o perfil funcional, devido à cobertura genética adicional.

Diferenças de cobertura microbiana e recomendações por tipo de amostra em estudos de microbioma

O Sequenciamento Shotgun analisa todo o DNA metagenômico, enquanto o Sequenciamento 16S se concentra apenas nos genes 16S rRNA, que também têm limitações de cobertura devido aos iniciadores. Como resultado, o Sequenciamento Shotgun tem uma cobertura mais ampla entre diferentes domínios.

No entanto, a Tabela 1 acima mostra que o Sequenciamento 16S/ITS é mais eficaz em cobrir bactérias e fungos. Isso ocorre devido à disponibilidade e extensão das bases de dados de referência. A precisão da previsão taxonômica nessas abordagens depende fortemente das bases de dados de referência utilizadas. Atualmente, as bases de dados 16S/ITS têm uma cobertura muito melhor do que as bases de dados de genomas completos.

Isso acontece porque os genomas completos de micróbios associados ao microbioma humano são mais bem estudados do que os genomas de micróbios de outros ambientes. É por isso que se recomenda o uso do Sequenciamento Metagenômico Shotgun para amostras relacionadas ao microbioma humano, como fezes e saliva, quando o foco principal é o perfil taxonômico.

Além disso, o sequenciamento metagenômico depende mais de bases de dados de referência. Por exemplo, se uma bactéria não tiver um parente próximo na base de dados de referência 16S, é possível que ela seja identificada em um nível taxonômico mais alto ou até mesmo como uma bactéria desconhecida. Porém, no Sequenciamento Shotgun, se uma bactéria não tiver um genoma de referência estreitamente relacionado (do mesmo gênero) na base de dados de genomas de referência, é possível que ela não seja nem detectada.

Por exemplo, o ZymoBIOMICS Spike-in Control I contém dois micróbios não relacionados ao microbioma humano (Imtechella halotolerans e Allobacillus halotolerans), cujos genomas não estavam previamente disponíveis. Se esses micróbios forem adicionados a uma amostra fecal e sequenciados com Sequenciamento Shotgun, a maioria dos pipelines bioinformáticos não os detectará, a menos que você inclua manualmente esses dois genomas na base de dados de referência. No entanto, se forem analisados com Sequenciamento 16S, eles serão identificados devido à presença de seus dados 16S nas bases de dados de referência.

Cuidados relacionados aos falsos positivos em estudos de microbioma

As ferramentas de correção de erros, como o DADA2, não apenas melhoram a resolução taxonômica no Sequenciamento 16S/ITS, mas também a precisão. Isso é evidenciado quando se sequencia o DNA de uma comunidade microbiana simulada, como o ZymoBIOMICS Microbial Community Standard. Todas as sequências 16S são recuperadas sem erros, ou seja, sem falsos positivos.

Por outro lado, no Sequenciamento Metagenômico Shotgun, a menos que exista um genoma representativo perfeito na base de dados de referência para um micróbio sequenciado, é provável que a análise bioinformática preveja a presença de múltiplos genomas “estreitamente relacionados”. Esses genomas estreitamente relacionados podem ser de espécies diferentes do mesmo gênero ou até de gêneros diferentes.

Por exemplo, suponhamos que existam três micróbios estreitamente relacionados, A, B e C, que compartilham algumas sequências em comum. A espécie A compartilha algumas sequências apenas com B e outras apenas com C. Se a base de dados de referência contiver apenas genomas de B e C, quando A for sequenciado, a análise bioinformática pode prever que tanto B quanto C estão presentes. Por exemplo, tanto A quanto B podem ser espécies de Escherichia coli e C pode ser Salmonella enterica. As sequências compartilhadas exclusivamente por B e C podem resultar de transferência horizontal de genes, que é comum entre micróbios estreitamente relacionados. Por essa razão, o sequenciamento 16S/ITS é mais preciso em termos de evitar falsos positivos.

É possível ter interferência do DNA do hospedeiro?

O excesso de DNA do hospedeiro pode causar amplificação não específica no processo de preparação da biblioteca para o Sequenciamento 16S e ITS, mas isso pode ser controlado ao ajustando os ciclos de PCR e modificando os iniciadores. Por outro lado, a interferência do DNA do hospedeiro é um desafio muito maior no sequenciamento Metagenômico Shotgun, mesmo com a redução dos custos de sequenciamento.

Dependendo do tipo de amostra, algumas podem conter mais de 99% de DNA humano do hospedeiro. Isso não apenas aumenta os custos de sequenciamento, mas também introduz incerteza nas quantificações. É por isso que muitos pesquisadores buscam a depleção do DNA do hospedeiro, como o uso do HostZERO Microbial DNA Kit, antes da preparação da biblioteca para o Sequenciamento Shotgun.

No entanto, após a depleção do DNA do hospedeiro, pode haver uma quantidade insuficiente de DNA genômico microbiano para o Sequenciamento Shotgun, pois geralmente é necessário pelo menos 1ng de entrada. A interferência do DNA do hospedeiro é a razão pela qual o Sequenciamento Shotgun superficial é recomendado com segurança para amostras fecais humanas.

Qual a quantidade necessária de DNA para cada sequenciamento?

O Sequenciamento Metagenômico Shotgun exige que a entrada possua uma quantidade mínima de 1ng de DNA, enquanto o Sequenciamento 16S/ITS é muito mais sensível, requerendo apenas femtogramas ou até mesmo 10 cópias de genes 16S rRNA.

A Zymo Research está aqui para te ajudar!

A escolha entre um Sequenciamento 16S ou um Sequenciamento Shotgun é uma etapa crítica em todo o estudo de microbioma. Além de levar em conta seu orçamento, é fundamental considerar diversos aspectos do seu projeto, como o tipo de amostra, as análises desejadas, a resolução taxonômica e os organismos-alvo. Levar em conta essas considerações te ajudará a escolher o método de sequenciamento mais adequado para o seu próximo projeto de microbioma.

Nossa unidade local oferece de forma completa da extração ao sequenciamento e análise de bioinformática os serviços de Sequenciamento 16S, ITS e Shotgun. Os serviços locais possuem os melhores protocolos de controle de viés com ZymoBIOMICS e o suporte de uma experiente equipe de especialistas. Os especialistas da Zymo Research ficarão felizes em auxiliá-lo na escolha do método de sequenciamento mais adequado ao seu estudo.

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