O campo de estudos de análises de microbioma baseadas em NGS(sequenciamento de nova geração) está passando por um momento decisivo. Formadores de opinião e consensos internacionais defendem o uso de padrões precisos e universais de comunidades microbianas, visando o aumentar a precisão dos dados e facilitar comparações entre estudos e laboratórios 1-5.

MIQ, um quociente calculado para quantificar e padronizar o viés

A disponibilização de comunidades microbianas simuladas disponíveis de forma comercial, difundiu o acesso aos controles de qualidade adequados. Porém, até então, não existia um método simples para quantificar o viés quando o uso desses padrões são empregados. Com a pontuação MIQ (do inglês: Measurement Integrity Quotient) a quantificação desse viés é simplificada através de uma nota numérica e relatório padronizado de fácil interpretação.

O que são comunidades microbianas simuladas?

Um padrão de comunidade microbiana simulada é uma mistura sintética de espécies microbianas conhecidas com uma porcentagem específica pré-definida de cada uma. O ideal é que as espécies contidas no padrão apresentem diversas características que representem os vários desafios que podem surgir durante um estudo de microbioma.

Essas características incluem:

• Uma ampla gama de resistência da parede celular e tamanhos de células para confrontar o viés de lise celular
• Um espectro de conteúdo de GC para testar o viés de sequenciamento e bioinformática
• A representação de vários reinos para avaliar a detecção de espécies nas diferentes tecnologias de sequenciamento.

Esses fatores permitem a avaliação precisa dos fluxos de trabalho de análise de microbiomas, mesmo que o padrão não contenha cepas específicas de interesse.

“Você está avaliando o que a análise está fazendo, não necessariamente o que está na comunidade.” – Explica o especialista Lynn Schriml do Instituto de Ciências do Genoma da Universidade de Maryland 6.

Como as comunidades microbianas simuladas controlam o viés?

O objetivo do padrão de comunidade microbiana simulada é de ser um controle positivo, executado como uma amostra única em paralelo com as amostras do estudo.

Esse controle positivo deve ser incluído em cada extração de ácidos nucleicos para detectar quaisquer viéses nas etapas de lise e purificação. Caso abundâncias relativas fora do esperado forem detectadas no padrão, há chance de que os vieses ocorridos durante o fluxo de trabalho tenham causado alterações no padrão conhecido e nas amostras desconhecidas. Muitos estudos estão adotando essa estratégia, incluindo várias publicações de alto nível 7-9.

Quantificando o viés através de um sistema de pontuação simples: MIQ

Embora esteja se tornando prática comum manter controles adequados, não existia uma solução simples para a análise de precisão quantitativa e completa. Esta questão foi discutida pelos principais líderes da área no Workshop NIST 2019 sobre Padrões para Medições de Microbiomas 10.

Hoje, o sistema de pontuação MIQ (em português, Quociente de Integridade de Medição) foi desenvolvido para resolver esse desafio. O MIQ torna a análise de padrão microbiano mais fácil e totalmente reprodutível. Através de um sistema de classificação sensível, é possível detectar até mesmo pequenos vieses introduzidos pelos métodos de preparação do microbioma.

Figura 1. A pontuação MIQ varia de 0 a 100 e funciona como uma nota para o viés. O relatório também inclui gráficos de radar que ilustram qualquer distribuição enviesada nas leituras.

MIQ começou como uma brincadeira, seus colegas de laboratório tinham apelidado o sistema com o nome do cientista que o criou (Mike). Porém, o termo se desenvolveu para a sigla: Measurement Integrity Quotient(MIQ) e descreve perfeitamente sua finalidade.

O sistema de pontuação MIQ simplifica a avaliação de viés, atribuindo uma pontuação de 0 a 100 que pode ser interpretada como se fosse uma nota em uma prova escolar. Ou seja, maior que 90 significa “excelente”, entre 80 e 89 significa “bom” e assim por diante (Figura 1).

Essa nota é obtida medindo a fidelidade das abundâncias relativas medidas em comparação com um número pré-determinado. A pontuação MIQ é apresentada através de um relatório simples que também inclui vários gráficos sobre a avaliação. São eles: gráficos de radar, gráficos de barra empilhada e classificações de leitura (Figura 2).

Figura 2. O relatório de avaliação de viés pelo sistema de pontuação MIQ. Inclui gráficos de barras demonstrando a abundância relativa e um gráfico de pizza de contagem de destino de leitura.

Como a pontuação MIQ é calculada?

Para avaliar o viés usando um padrão de comunidade microbiana simulada, começamos com a tolerância de fabricação do padrão que está sendo usado. A tolerância de fabricação é o potencial de variação que uma espécie pode ter em relação à sua abundância pretendida.

Por exemplo, a tolerância de fabricação do Padrão de Comunidade Microbiana ZymoBIOMICS é de 15%, o que significa que se esperamos que 10 em 100 células são células B. subtilis, o número real de células B. subtilis deve variar entre 8,5 a 11,5. É importante usar um padrão com tolerância mínima de fabricação, como o Padrão de Comunidade Microbiana ZymoBIOMICS, pois a avaliação da precisão só adequada se dispor de bons controles.

A pontuação MIQ mede desvios de abundância relativa esperada que não podem ser descobertos através da tolerância de fabricação.

1. Primeiro, definimos 100% como a porcentagem esperada para cada espécie no padrão.
2. Depois, usando a tolerância de fabricação do Padrão de Comunidade Microbiana ZymoBIOMICS, qualquer abundância relativa que esteja fora dos 15% esperado representa um desvio que não pode ser explicado pela tolerância de fabricação (Figura 3).
3. Por fim, pode-se supor que seu desvio tenha sido causado por um ou vários vieses resultantes do fluxo de trabalho. Por outro lado, se a abundância observada estiver dentro da faixa de tolerância de fabricação, provavelmente não sofreu nenhum viés que causaria esse desvio (Figura 3).

Figura 3. Quanto maior o desvio em relação à tolerância de fabricação do padrão menor a pontuação MIQ.

A pontuação MIQ é atribuída medindo a raíz do erro quadrático médio (REQM) das abundâncias que estão fora da faixa de tolerância de fabricação. A REQM é uma ferramenta estatística muito utilizada para medir a precisão relativa em relação a um valor conhecido. Essas REQM são então subtraídas de 100 para gerar a pontuação MIQ.

Nossa ajuda no aprimoramento das pesquisas de microbioma

Para impulsionar a qualidade e a reprodutibilidade dos dados de microbiomas de nossos pesquisadores parceiros, os aplicativos MIQ Score estão disponíveis gratuitamente. O código-fonte das versões para dados de sequenciamento 16S e Shotgun podem ser baixadas através da página GitHub da Zymo Research ou como imagens pré-criadas no Docker.

ANALISE HOJE MESMO SEUS DADOS DE COMUNIDADE MICROBIANA SIMULADA COM O MIQ SCORE

ACESSE AS FERRAMENTAS DE PONTUAÇÃO MIQ (Em Inglês)

1. Sinha R, Abnet CC, White O, Knight R, Huttenhower C: The microbiome quality control project: baseline study design and future directions. Genome Biol 2015, 16:276
2. Costea PI, Hildebrand F, Arumugam M, Bäckhed F, Blaser M, Bushman FD, de Vos WM, Ehrlich SD, Fraser CM, Hattori M et al: Enterotypes in the landscape of gut microbial community composition. Nature Microbiology 2018, 3(1):8-16
3. Stulberg E, Fravel D, Proctor LM, Murray DM, LoTempio J, Chrisey L, Garland J, Goodwin K, Graber J, Harris MC et al: An assessment of US Microbiome Research. Nature Microbiology 2016, 1:15015
4. Jackson SA, Kralj JG, Lin NJ. Report on the NIST/DHS/FDA Workshop: Standards for Pathogen Detection for Biosurveillance and Clinical Applications. NIST.gov 2018, Special Publication (NIST SP) – 1222
5. Jones MB, Highlander SK, Anderson EL, Li W, Dayrit M, Klitgord N, Fabani MM, Seguritan V, Green J, Pride DT. Library preparation methodology can influence genomic and functional predictions in human microbiome research. PNAS 2015, 112(45):14024-14029
6. Zymo Research. From Gut Instinct to Gold Standard. 2018.
7. Danko D, et al. A global metagenomic map of urban microbiomes and antimicrobial resistance. Cell 2021, 184(13): 3376-3393.
8. Karst S , Ziels R, Kirkegaard R, Sørensen E, McDonald D, Zhu Q, Knight R, Albertsen M. High-accuracy long-read amplicon sequences using unique molecular identifiers with Nanopore or PacBio sequencing. Nature Methods 2021, 18: 165-169.
9. Bullman S, Pedamallu CS, Sicinska E, Clancy TE, Zhang X, Cai D, Neuberg D, Huang K, Guevara F, Nelson T, Chipashvili O, et al. Analysis of Fusobacterium persistence and antibiotic response in colorectal cancer. Science 2017, 358(6369):1443-1148
10. 2019 NIST Workshop on Standards for Microbiome Measurements