Na era de pesquisas avançadas em microbiologia, a análise de microbioma emerge como um campo de estudo crucial para compreender nossa saúde e bem-estar. Contudo, à medida que os cientistas se aprofundam nesse território microscópico, desafios intrigantes vêm à tona. Um desses desafios é a divergência nos resultados de extração de DNA de uma mesma amostra, quando processada por diferentes laboratórios. Embora a expectativa seja que os resultados sejam consistentes, essa não é sempre a realidade. Este artigo explora por que isso ocorre, destacando causas do viés de lise na extração de DNA e a importância de um fluxo de trabalho rigoroso para obter resultados confiáveis e significativos em estudos de microbioma.

Como o resultado final de uma análise de microbioma de uma mesma amostra pode não coincidir se realizada em diferentes laboratórios?

Em um mundo ideal, sabemos que uma mesma amostra deve possuir os mesmos resultados, independente de qual laboratório ela for processada. Porém, infelizmente, esse não tem sido o caso de muitas análises de microbioma, mesmo quando as análises são realizadas em laboratórios já conhecidos.

• Por exemplo: A American Gut Project e a extinta uBiome são dois populares laboratórios que realizaram análises de perfil da microbiota intestinal dos Americanos. Porém, ao receberem a mesma amostra fecal, as duas organizações relataram perfis de microbioma intestinal dramaticamente diferentes!(veja na Figura 1) [1]

Note que a proporção de bactérias dos filos Firmicutes e Bacterioidetes estão com as proporções divergentes entre os dois resultados.

• Outro exemplo: ao comparar o resultado de dois dos maiores projetos de perfis de microbioma, o Human Microbiome Project (HMP) e o Metagenomics of Human Intestinal Tract (MetaHIT), temos uma surpresa. Nesse caso, os estudos analisaram o microbioma intestinal humano de centenas de amostras, o resultado aponta que os dois filos dominantes (Bacteroidetes e Firmicutes) tiveram abundâncias relativas extremamente diferentes (veja a Figura 2).

Acredita-se que a diferença foi causada por variações técnicas durante o procedimento de extração de DNA, como apontado por Wesolowska-Andersen et al. [2].

O que pode dar errado durante a extração do DNA e a análise de microbioma?

Provavelmente, os resultados conflitantes mencionados acima são derivados do viés de lise, gerado pela complexidade das mensurações do microbioma. O fluxo de trabalho em uma análise de microbioma por NGS tem muitas etapas, e cada etapa possui diversos fatores que podem resultar em um resultado final com viés (mais detalhes na Figura 3 abaixo).

Grande parte dos protocolos usados em experimentos com análise de microbioma foram criados antes do desenvolvimento dessa área de estudos. Portanto, são fluxos de trabalho que não foram projetados com foco em atender às complexidades envolvidas no manejo de comunidades microbianas complexas.

Um exemplo é o próprio método de extração de ácidos nucleicos, no qual, mesmo extraindo um DNA com alto grau de pureza, é um processo que não foi projetado pensando em preservar as abundancias relativas de cada tipo de microrganismo presente na amostra. Por isso, há a possibilidades de que o procedimento tenha eficiência em extrair apenas o DNA das bactérias de fácil lise, apresentando dificuldade em extrair o DNA das bactérias mais resistentes. O resultado final seria um perfil com viés e diferente do esperado.

Como evitar o viés em minha análise de microbioma?

Sabemos que lidar com resultados divergentes na área de microbioma é bastante desafiador. Por isso, a equipe de especialistas da Zymo Research desenvolveu uma série de ferramentas focadas em auxiliar o pesquisador à mitigar o viés em todas as etapas do seu processo de análise de Microbioma e Sequenciamento de Nova Geração(NGS). Contamos com um amplo portifólio de produtos, que vai desde reagentes para proteger sua coleta de amostras até padrões para comparação, controles e amostras de referência.

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Referências

1. Saey TH: Here is the poop on getting your gut microbiome analyzed. In: Science News. vol. 2017; 2014.2.

2. Wesolowska-Andersen A, Bahl MI, Carvalho V, Kristiansen K, Sicheritz-Ponten T, Gupta R, Licht TR: Choice of bacterial DNA extraction method from fecal material influences community structure as evaluated by metagenomic analysis. Microbiome 2014, 2:19.